近年来免疫学检测技术的最新研究进展概述

重金属免疫检测技术作为一种新型的检测技术，具有灵敏、快速、携带方便、成本低等优点，可用于现场快速检测。概述了近年来免疫检测技术的最新研究进展，并展望了该方法在食品安全检测中的发展趋势和应用前景。关键词：重金属；免疫检测；酶联免疫吸附反应；胶体金免疫层析法；荧光偏振免疫分析法Abstract: Heavy metal immunoassays are new methods for detection of heavy metal ions. Compared to the traditional chemical methods, immunoassays are not only fast, cheap, ** , but also reasonably portable, highly sensitive and selective. It could be used for rapid detection site. The recent progress of immunoassay was introduced briefly. And the tendency of development in immunoassay and its prospect used in the food safety determination were also forward promoted.Key words: Heavy metal; immunoassays; ELISA; colloidal gold immuno-

随着全社会对食品安全和环境保护的日益重视，重金属污染已成为一个全球性的问题。在环境污染方面，重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬和类金属砷，以及有毒的重金属铜、钴、镍、锡、钒等污染物。这种有毒物质通过食物链浓缩，在体内不断积累，主要为慢性中毒和长期效应，具有巨大的潜在危害。据国家环保局不完全统计，全国重金属污染粮食每年达到1.2×106万kg，直接经济超过200亿元，不同程度的重金属污染约有2000万耕地hm2.约占耕地总面积的1/5。我国水体重金属污染问题也十分突出，江河湖底污染率高达80.1%。一旦重金属污染了环境，就很难自然修复，随着食物链牲畜的积累和传递，对食品安全和人民健康构成了严重威胁 。因此，近年来重金属污染越来越受到到人们的重视，针对重金属常用的传统检测方法包括电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、石墨炉原子吸收光谱法(GF-ASS)、火焰原子吸收法(FASS)紫外分光光度法(UV)等。传统的检测方法具有省时、快速、准确、敏感的优点，是国家重金属安全检测的金标准。传统的检测方法准确可信，但往往需要大型设备和专业人员操作，具有一定的时间和地点限制，不适合快速、现场定量检测。在突发环境污染事件检测和大规模取样实时监测中，需要建立敏感、高效、快速、方便的检测方法。因此，基于单克隆抗体制备和应用的免疫检测技术为环境和食品样品中重金属的快速定量或半定量检测提供了有效的途径。本文综合讨论了近年来重金属检测中的样品预处理和免疫检测技术，并对未来的研究发展方向进行了展望。

1 样品前处理

在实际样品中，重金属往往以化合物的形式存在，一般不能直接检测。这就要求样品前处理去除干扰因素，并将金属离子释放到液相检测环境中进行后续检测。样品预处理需要尽可能完整地保留被测成分，并有效地浓缩被测成分。检测前选择合适的预处理方法是非常重要的。目前，重金属残留检测中常用的样品预处理方法有湿消解、干灰化、微波消解、酸浸提等。1.1 湿消化法湿消化法是通过强酸在高温条件下破坏有机物释放金属离子。该方法适用于大多数样品，回收率高，但需要消耗大量的强酸和大量的有害气体，对环境和人体造成更大的损害。常用的酸是硝酸、高氯酸等混合酸消化。1.2 干灰化法在高温下燃烧样品，分解挥发大量纤维素、蛋白质、油脂等有机物质，只留下矿物质灰分。该方法操作简单，污染小，但消化周期长，灰化温度高，部分元素蒸发损失，坩埚等材料吸附效果低，回收率低。1.3 微波消解法微波消解利用微波的渗透性和激活反应能力，在密封装置中快速提高样品温度，加入一定量的酸溶液，分解样品中的有机物。Ghaedi通过微波消解法提取重金属后，用表面活性剂修饰的活性碳丰富重金属，以减少其分析方法的检测限制。Amorim Filho石墨炉原子吸收光谱用硝酸和双氧水混合微波消解样式测定抗生素Cd2 和Pb2 含量。1.4 酸提取法通常是酸提取法，即盐酸或硝酸直接提取所需的成分。其直接采样技术具有操作简单、速度快、不污染环境、避免被测元素挥发性损失等优点。李支微等使用稀 HCl、HNO3及H2SO4.浸提样品，探索蔬菜中的重金属Cu2 、Pb2 、Cd2 最适浸提条件。Wei Gao等采用1M NH4Ac浸泡在土壤中Cd2 并对免疫学进行了分析和测定。

2 制备重金属特异性抗体

自Reardan第一次通过组建In3 -L-benzyl-EDTA-BSA复合抗原重并制备In3 自特异性抗体以来，国内外专家学者通过重金属和螯合剂配置形成了半抗原，然后通过免疫动物、细胞融合、阳性细胞株筛选和克隆过程制备了大量的高特异性单克隆抗体，为重金属免疫检测技术的发展提供了基础。

3 重金属离子免疫检测方法

通过对重金属残留快速检测技术的深入研究和讨论，产生了酶联免疫吸附反应、胶体试纸法、生物化学传感器法、荧光分析法等多种快速检测方法，免疫检测方法具有方便、操作简单、反应快、携带方便、分析成本低等传统方法的优点，表明该检测方法可应用于大量样品的现场检测，也可应用于食品安全监测或环境检测方面。3.1 酶联免疫吸附反应（ELISA）酶联免疫吸附反应是一种结合抗原抗体特异性免疫反应和酶催化作用的检测技术。具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、操作简单、携带方便、快速准确等优点。一般不需要贵重的仪器设备和专业技术人员，操作简单，易于普及推广。ELISA间接竞争是检测重金属的常用方法ELISA和直接竞争ELISA。3.1.1 间接竞争ELISA其原理是在固相载体上添加待检样品（竞争对手）和特异性单克隆抗体。抗原与待检样品中的竞争对手结合单克隆抗体的相同表位。酶标二抗孵化后，底部可根据标准曲线确定样品中待检物的含量。Wei Gao等用乙二酸四乙胺(EDTA)螯合重金属Cd2 并联卵清蛋白(OVA)免疫原免疫Balb/c获得特异性单克隆细胞株4的小鼠F3B6D9A1。腹水抗体净化后间接竞争ELISA(icELISA)抑制率和抑制范围分别为2.59 ng/mL和0.20-40 ng/mL，除与Mn2 有2.9%和Hg2 有1.其他金属离子在6%交叉外的交叉反应小于1%。在实际样品检测中其结果与石墨炉原子吸收光谱（GFAAS）测量值的平均相关性为0.9873。Yuzhen Wang等[20]高特异性的人Hg2 基于单克隆抗体的建立icELISA检测水样、牛奶和蔬菜中重金属的方法Hg2 含量，该icELISA检测范围是0.1-100 ng/mL，其IC分别达到150和最低检测限.12 ng/mL和0.08 ng/ mL。在实际样品检测时回收率为80.00%-113%的检测结果令人满意。实际样品检测回收率为80.00%-113%的检测结果令人满意。.1.2 直接竞争酶联免疫吸附反应是将样品中的重金属离子与螯合剂与定量重金属离子螯合剂-螯合剂-酶复合物混合后，将包裹在固相载体上的抗体与一步竞争免疫检测原理结合起来。Blake人们使用辣根过氧化物酶（HRP）标记Cd2 -EDTA环境水样中的复合物采用直接竞争免疫检测法Cd2 检测限为0.3ug/ml，其它杂质离子Ca2 、Mg2 、Fe3 不干扰检测结果。检测结果与原子吸收法的检测结果一致，标准产品回收率达到100.29±3.60%。之后Darwis采用直接竞争免疫检测法对人血清进行Cd2 检测含量。将抗Cd2 -EDTA复合抗体直接包裹在底板上，从血样中分离出来Cd2 与适量EDTA将复合物与竞争对手结合起来，形成固定在底板上的抗体表面，重金属镉含量经底物显色后分析。检测浓度范围为0.24～100μg/L，与人血中其他金属无交叉，与原子吸收检测结果相关系数为0.984。3.2 胶体金免疫分析技术3.2.1 胶体金免疫层析法（CIA）其原理是将特异性抗体标记在金颗粒上，然后固定在金垫上。抗原和二抗分别标记在硝酸纤维素膜上。在硝酸纤维素膜的滴加待检样品中，样品移动到硝酸纤维素膜的一端，并与金垫上的标记抗体结合。当样品到达抗原时，若样品中的待检物量不足与所有标记抗体结合则胶体金标记抗体便与膜上固定的抗原结合而显色，若待检物与标记抗体完全结合则不与固定在膜上的抗原结合，而是移动到固定有二抗的区域后显色。它可以快速定性或半定量检测重金属离子，操作简单、快速、特异性高。以前，它阻碍了胶体金技术的发展，因为它只能用于定性实验。现在有相关文献报道胶体金免疫分析技术可用于定量重金属检测。Kaoru Abe等人发明的颜色扫描仪利用在Cd2 -EDTA络合物和抗Cd2 -EDTA检测抗体特异性反应形成的抗原抗体复合物浓度Cd2 浓度的检测限制≤0.01 mg/L。由于抗原-抗体复合物的反应是定量的，采用了一系列浓度梯度的标准Cd2 -EDTA与抗Cd2 -EDTA抗体反应后，使用颜色扫描仪确定显色程度，以此为标准，对实际大米样品和土壤样品中镉含量胶体金进行免疫分析检测。3.2.2 免疫荧光分析是在胶体金免疫分析技术的基础上形成的一种新型免疫分析技术，以荧光物质为标记物，应用于抗原抗体反应。3.2.2 免疫荧光分析是在胶体金免疫分析技术的基础上形成的一种新型免疫分析技术，以荧光物质为标记物，应用于抗原抗体反应。该技术已广泛应用于医学检测、食品安全监测、环境污染检测等方面。傅强强等人建立了一种新型荧光淬灭免疫层分析试纸条，其检测信号强度与检测对象浓度呈正相关，并成功制备了小分子重金属检测Cr3 荧光淬灭免疫层析试纸条为重金属和免疫层析试纸条的发展提供了新的方向。3.3 相应的抗体或抗原测定或定位技术称为免疫荧光技术。免疫荧光偏振技术是在免疫荧光技术的基础上形成的。免疫荧光技术是指利用荧光物质标记抗原抗体来测量或定位相应抗原抗体的技术，适用于中小分子物质的测量。荧光素标记抗原后，添加定量抗体和待测物体。待测物体与标记抗原竞争结合抗体的表面位置相同。当待测物体中的抗原浓度较高时，游离标记抗原浓度较高，荧光偏振减弱。基于此原理，固定异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗原（FITC-taxol）和抗体（taxol-antibody),加入待测样品(包括未标记的样品)taxol），与标记的taxol竞争会导致荧光偏振下降。并由P/P0可以给出taxol确定待测样品的标准曲线taxol含量。3.4 荧光分析法荧光分析法的基本原理是，荧光物质可以吸收光能成为激发状态，然后恢复到基本状态，同时发出某个平面的偏振光，发出单个平面的偏振荧光。基于重金属离子能对荧光物质产生荧光猝灭或荧光增强作用，并随浓度增大产生的猝灭或增强作用越大这一原理对重金属离子原理进行荧光分析检测。有机荧光染料、量子点和稀土纳米材料是常用的能发射荧光的物质。HuiLin基于荧光共振能转移等CdSe和CdTe量子点对前列腺抗原（PSA），在最佳条件下PSA抗原的线性范围为2.8-10μg/ml，相关性系数R =0.9992检测限为1.5×10-2μg/ml。荧光分析法和传统仪器检测方法相比，具有更高的灵敏度和更低的检测范围而且进行样品检测时无需进行分离富集显色等操作过程，大大简化了操作流程。但荧光物质只对部分重金属离子如Hg2+、Cu2+、Ag＋、Pb2+和Co2+离子有响应。且对许多自身不发荧光的物质进行检测时需要预先加入荧光标记物才能进行荧光分析，这些问题在一定程度上限制了荧光分析的发展。

4 讨 论

随着经济社会的迅速发展，食品中重金属污染问题越来越受到人们的重视，对于如何快速准确检测样品中的痕量重金属离子成为世界性的研究热点。仅依靠传统检测手段并不能很好的满足人们的检测需求时，因此，需要多方面的科研人员运用现代高新技术来研发特异性强、灵敏度高、方便、快捷的重金属检测方法。近年来免疫学检测技术蓬勃发展，抗重金属离子的高亲和力和高特异性抗体的制备为免疫检测提供了发展的基石，新技术手段和新标记技术的不断涌现更加突进免疫学检测技术的发展。它广泛应用于食品安全中重金属污染的检测，但检测样品多为水样、液体样，实际样品前处理到免疫学检测过程还未成熟存在着技术难点，食品中重金属快速免疫学检测还需要进一步研究与探索。但随着蛋白质工程，基因工程的快速发展，经过抗体改造，修饰或基因重组后获得高特异性，高灵敏度和更稳定的单克隆抗体成为免疫学学检测技术发展的关键，为运用免疫学检测手段快速检测食品中的痕量重金属离子提供了发展空间。