分子生物学实验RNA的提取

分子生物学实验RNA的提取

分析或构建基因表达cDNA我们经常需要从组织或细胞中获取文库RNA。与蛋白质合成有关的细胞RNA可分为信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）三大类。不同组织总RNA提取的本质是裂解和释放细胞RNA，以不同的方式去除蛋白质，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产品的过程。纯度高，完整性好RNA，对后续实验至关重要。

不同类型和来源RNA根据原理，有不同的提取方法。常的方法有梯度密度离心法、氯仿提取法、离子交换法、盐分析法和硅胶膜法。在这些方法中：

离子交换法获得RNA纯度最高。

硅胶膜法RNA纯度高，但耗时更短更方便。

在众多提取方法中

Trizol提取方法是最常见、最经典的方法。

01基本原理

Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法。

强变性剂异硫氰酸胍首先裂解细胞，使细胞裂解 ** 蛋白质变性在白复合体中。

在特定pH因为条件DNA和RNA分离的溶解度不同，DNA位于中间相，RNA位于水相，然后有机溶剂沉淀RNA可获得高纯度RNA。

02抽提过程

在抽提RNA在此之前，我们首先需要预处理样品。

我们应该选择新的组织作为抽提RNA避免使用坏死组织；RNA当细胞生长旺盛时，应收集细胞。

对于一些靠近墙壁的细胞，消化和离心应迅速，必要时可直接进入裂解环节。通过敲击、冲击和吹击收集细胞可以确保细胞的代谢状态和活性。

样本离开活体后，内源性RNA酶就会被释放出来。人体的细胞中的RNA在20min它将被降解一轮，因此，在获得样品后，应迅速研磨并加入裂解液；对于不易破碎的组织，可将其切成小块，放入液氮中。简而言之，样品的预处理过程必须很快。

03RNA检测纯度和完整值

RNA获得完整性检测RNA后，应对RNA检测纯度和完整性，确保获得RNA的质量。

真核生物的RNA一般有四条特征条带：28S，18S，5.8S，5S；

植物组织一般有三个特征条带：28S，18S，5S；

理论上，原核生物也有三个特征条带：23S，16S和5S。

对真核生物RNA，1%琼脂糖，10V/cm在琼脂糖凝胶电泳的电压下，每10次min一次成像。如果没有28s条带，说明28s已被破坏。

提取结果一般具有以下特点：

有3条特征条带（5s、18s和28s）,并且28s条带亮度为18s大约是两倍。果有多条带，说明RNA被污染或破坏RNase琼脂糖凝胶电泳处理后应无明显残留，否则样品已初步判断DNA污染。

真核生物rRNA的28s亚基和18s提取过程中可能会降解亚基，实验中可以使用28S/18S作为衡量提取RNA完整性指标。S/18S为1.8~2.在0的范围内，可以认为是提取物RNA完整性好。

RNA纯度的检测

常用于实验OD260/280来检测RNA纯度，同时OD以260/230为参考值，不同比值的意义如下：

04防止RNase的污染

内源性RNase是造成RNA降解的主要原因。收集样本时，内源性RNA酶释放会降解RNA，其降解速度和内源性RNase其含量与环境温度有关。RNA使用适当的均匀浆法和裂解液，控制起始量有助于避免内源性RNase导致的RNA降解。

外源性RNase也是导致RNA降解的重要原因。

在实验过程中，需要戴帽子、口罩和无菌手套。在清洁灰尘较少的实验中进行操作 ** 成功。特别注意枪头和枪头EP管道。在实验操作中，枪头可以和EP管浸泡在DEPC在溶液中，备用高压灭菌。必要时，也可在实验中使用商业化RNase inhibitor。